Zelf kopiëren, knippen en plakken
Begrijpen hoe een cel zélf genen vertaalt in eiwitten is één ding, maar de moderne moleculaire biologie en synthetische biologie zouden niet mogelijk zijn geweest zonder de mogelijkheid om genen ook te manipuleren.
Het helpt daarbij natuurlijk enorm dat de genetische ‘taal’ voor alle levende organismen in de basis dezelfde is. Het is anno nu dan ook mogelijk om een gen uit een zoogdier in te bouwen in een bacterie. Het bijbehorende zoogdiereiwit is hierdoor relatief eenvoudig op grote schaal te produceren, omdat bacteriën veel sneller groeien. Ook het bestuderen van het betreffende eiwit wordt hierdoor een stuk makkelijker.
Het is ook mogelijk om genen te veranderen, ofwel te muteren. Hierbij wordt een base, of zelfs grotere delen van het DNA aangepast, waardoor het eiwit een ander aminozuur zal bevatten. Het aanpassen van eiwitten maakt het niet alleen mogelijk om hun specifieke functie te bestuderen, het is ook mogelijk om ‘verbeterde’ varianten te maken. Zo kunnen we nu humaan insuline grootschalig produceren in micro-organismen, en zijn er ook verbeterde varianten van dit insuline op de markt.
Schaar en lijm: restrictie en ligatie
Begin jaren zeventig zijn enzymen ontdekt die dubbelstrengs DNA op specifieke plaatsen knippen. Deze zogenoemde restrictie-endonucleasen herkennen een sequentie in het DNA en knippen de binding tussen twee basen in beide strengen. De sequentie die wordt herkend door een restrictie-enzym varieert in lengte van 4 tot 8 baseparen. Vaak zijn de sequenties palindromen: andersom gelezen staat er hetzelfde. Met restrictie-enzymen kun je bijvoorbeeld een gen losknippen uit een chromosoom.
Na het ‘asymetrisch knippen’ door het enzym blijft er op de plek van de breuk een los stukje enkelstrengs DNA over. In het jargon van de moleculair bioloog heet dit een ‘plakkerig eind’. Dat deel kan vervolgens hechten aan een complementair plakkerig eind van een ander stuk DNA, wat met hetzelfde restrictie-enzym is behandeld. Vervolgens kan het losgeknipte gen in een andere streng DNA worden ingebouwd. Speciale enzymen, de ligasen, kunnen de stukken DNA aan elkaar plakken, zodat weer een intact DNA-molecuul ontstaat.
Met behulp van een restrictie-enzym en ligase kan een gen worden geknipt om het in een ander stuk DNA te plakken.
Stichting Biowetenschappen en Maatschappij
De kopieermachine: PCR
De hoeveelheid DNA die uit een celcultuur gewonnen kan worden is relatief klein. Om toch met substantiële hoeveelheden DNA te kunnen werken zijn verschillende technieken beschikbaar. Een van deze methoden, de polymerase kettingreactie (PCR) maakt gebruik van het enzym DNA-polymerase dat ook tijdens normale celdeling het DNA van de cel kopieert. Het DNA wordt in dat proces opengeritst door een helicase, waarna het DNA-polymerase een complementaire streng DNA produceert.
PCR werd in 1983 bedacht door de Amerikaanse biochemicus Kary Mulis, die daar tien jaar later de Nobelprijs voor scheikunde voor kreeg. Met recht, want de PCR heeft sinds de jaren tachtig voor een ware revolutie gezorgd in de moleculaire biologie. Met deze techniek kan een stukje DNA buiten de cel een enorm aantal keren gekopieerd worden, waardoor in principe één DNA-molecuul al voldoende is voor bijvoorbeeld de identificatie van een individu, het bepalen van evolutionaire verwantschap van soorten, of het verbouwen van een cel.
Tijdens de PCR-procedure wordt eerst het DNA met het interessante gen verwarmd. Daardoor treedt denaturatie op: de strengen laten elkaar los. Daarna wordt de temperatuur iets verlaagd, zodat zogenoemde primers kunnen binden. Primers zijn kleine, kunstmatige stukken DNA, die aan de weerszijden van het gewenste gen kunnen binden. Het DNA-polymerase in de PCR-methode is meestal gewonnen uit een thermoresistente bacterie, waardoor het de warmtebehandeling in de PCR procedure probleemloos overleeft. Dat DNA-polymerase gaat vanaf de primer tegen het enkelstrengs DNA een complementaire streng bouwen. Na een eerste cyclus wordt het dubbeldradig DNA door verhitting weer enkelstrengs en start een nieuwe cyclus. Bij die nieuwe cyclus wordt niet alleen het oorspronkelijke DNA, maar ook de kopie gekopieerd. Op die manier levert een beperkt aantal cycli al miljoenen kopieën van het betreffende gen op.
PCR kan ook worden gebruikt om een gemuteerd gen te maken. Door een beperkt aantal nucleotiden van de primer te veranderen bindt deze nog wel aan het gen, maar zal het in de volgende cyclus anders worden gecomplementeerd. Dit gemuteerde gen wordt vervolgens vermeerderd. Ook kan er gebruik worden gemaakt van een DNA-polymerase dat vaker foutjes maakt bij het inbouwen van nucleotiden. Dit wordt ‘fout-gevoelige PCR’ genoemd. Het zorgt voor willekeurige mutaties, waardoor de evolutie van een gen of een compleet organisme kan worden versneld.
Met de polymerase kettingreactie kan een stukje DNA buiten de cel een enorm aantal keren worden gekopieerd.
Stichting Biowetenschappen en Maatschappij
DNA uit de fabriek
Een andere manier om genen in handen te krijgen is chemische DNA-synthese. Toen deze methode net werd ontwikkeld was de lengte van de gesynthetiseerde stukken DNA erg beperkt. Er konden alleen kleine DNA-primers worden gemaakt. Inmiddels is deze methode behoorlijk verbeterd en goedkoper geworden. Nu kunnen stukken tot wel 10 kb (10.000 basen) worden gemaakt.
Van los DNA naar een functioneel gen
Aan een los gen in een reageerbuis heb je niet veel. De volgende stap is het inbrengen van het DNA in een functionerende cel. Dit heet transformatie. Inbrengen van een willekeurig stuk DNA kan in principe wel, maar zulk DNA beklijft niet in de getransformeerde cel. Daarom worden voor de transformatie zogenoemde plasmiden gebruikt. Dit zijn circulaire stukken DNA, die van nature ook voorkomen in bacteriën.
Een plasmide heeft een origin of replication waardoor het op eigen kracht kan repliceren in de cel. Een andere belangrijke component voor een plasmide dat goed bruikbaar is voor een moleculair bioloog is de multiple-cloning site. Daar zitten verschillende korte sequenties achter elkaar, die herkend kunnen worden door restrictie-enzymen. Zo kan het plasmide eenvoudig op die plek worden opengeknipt om er vervolgens één of meerdere genen in te plakken. De genen die zo ingebouwd worden in het plasmide, zullen zich na transformatie als onderdeel van het zelfreplicerend plasmide handhaven en doorgedeeld worden. Verder zit er ook een promotor en een terminator in het plasmide ter plekke van het ingebouwde gen. De promotor is een sequentie die de mate van expressie van het gen bepaalt. De plasmiden bevatten ook genen om te selecteren op cellen die deze plasmide bevatten. Meestal is dit een gen dat zorgt voor resistentie tegen een bepaald antibioticum. Wanneer het antibioticum wordt toegevoegd aan de celcultuur gaan alle cellen dood die de plasmide niet hebben. Zo worden alleen de cellen die het gewenste gen dragen geselecteerd.
